Иммунофлуоресцентный анализ

Лабораторная диагностика гриппа и ОРВИ

Известно более 200 разновидностей вирусов, избирательно поражающих респираторный тракт человека (возбудителей ОРВИ).

У большинства возбудителей ОРВИ первичное размножение вирусов происходит в слизистой оболочке дыхательной системы, поэтому клиническая картина сходная, заболевание протекает в виде ринита, ринофарингита, как правило, в легкой форме. У детей раннего возраста вирусы могут поражать нижние отделы респираторного тракта, и болезнь протекает в более тяжелой форме в виде бронхитов, бронхиолитов, пневмоний. Наиболее тяжело протекающей острой вирусной респираторной инфекцией является грипп, который часто принимает эпидемическое распространение, характеризуется явлениями общей интоксикации, лихорадкой, поражением дыхательного тракта, нервной и сердечно-сосудистой систем. Максимальное число тяжелых форм течения инфекции наблюдается в период пандемий, обусловленных новым вариантом вируса гриппа.

Лабораторная диагностика — ранняя и ретроспективная — проводится для подтверждения клинического диагноза, дифференциации гриппа от ОРВИ другой этиологии и для эпидемиологических целей. Вирусологическая лаборатория ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Курской области», входящая в состав опорной базы Федерального центра по гриппу и острым респираторным вирусным инфекциям, проводит исследования с целью этиологической расшифровки заболеваемости гриппом и ОРВИ, в том числе в организованных коллективах детей и взрослых, проведение лабораторных исследований в целях расшифровки региональной структуры заболеваемости гриппом и ОРВИ. Лаборатория оснащена современным оборудованием, имеет необходимые диагностические препараты, укомплектована высококвалифицированными специалистами.

Лаборатория оуществляет диагностику с помощью экспресс-методов, вирусологических и серологических методов исследования. Быстрая (экспресс) диагностика гриппа и ОРВИ:

1)метод флюоресцирующих антител (МФА) — основан на выявлении вирусных антигенов в клетках эпителия носовых ходов, конъюнктивы (при явлениях конъюнктивита). Исследуемый материал: мазки из носа, конъюнктивы, взятые в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни. Определяемые возбудители: — вирусы сезонного гриппа типа А (h2N1) — вирусы сезонного гриппа типа А (H3N2) — вирусы гриппа типа В — вирусы парагриппа 1, 2, 3 типов — аденовирусы — респираторно-синцитиальный вирус;

2) метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)- основан на обнаружении в клинических пробах генетического материала вирусов (РНК или ДНК)- является наиболее современным, высокочувствительным методом.

Исследуемый материал: мазки из носа и зева, взятые в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни, секционный материал. Определяемые возбудители:

— вирусы пандемического высокопатогенного гриппа типа А (h2N1)

— вирусы гриппа типа А

— вирусы гриппа типа В — вирусы парагриппа 1, 2, 3,4 типов

— аденовирусы — респираторно-синцитиальный вирус;

Вирусологическая диагностика — выделение вируса на чувствительной клеточной культуре с последующей идентификацией в реакции нейтрализации или ПЦР.

Этот метод отличается трудоемкостью и длительностью и используется, главным образом, для эпидемиологических и научных целей (изучается изменчивость вирусов, что помогает прогнозировать эпидемические подъемы гриппа, отбираются актуальные штаммы, пригодные для изготовления вакцин) Исследуемый материал: мазки из носа и зева (в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни).

Определяемые возбудители:

— вирусы гриппа типа А (разные серотипы)

— вирусы гриппа типа В Серологическая диагностика является ретроспективной. Она выявляет прирост титров антител к возбудителям заболевания в парных сыворотках крови, что позволяет установить точную этиологию даже при отрицательных результатах других методов лабораторной диагностики, а также при бессимптомном или атипичном течении гриппа, широко применяется и для эпидемиологических целей. Исследуемый материал: сыворотки крови, взятые в начале заболевания и через 10- 14 дней.

Возбудители к которым определяется прирост титров антител:

— вирусы сезонного гриппа типа А (h2N1)

— вирусы сезонного гриппа типа А (H3N2) — вирусы гриппа типа В

— вирусы парагриппа 1, 2, 3 типов

— аденовирусы

— респираторно-синцитиальный вирус;

В период подьема заболевамости гриппом и ОРВИ (в октябре- декабре 2009г.) вирусологической лабораторией обследовано методом флюоресцирующих антител (МФА) 432 человека. У 27% заболевших был выявлен аденовирус, у 8,3% — вирус парагриппа 3 типа, у 8% — респираторно-синцитиальный вирус, у 2% — вирусы парагриппа 1, 2 типов, у 0,2% — вирус сезонного гриппа типа А (h2N1).

При обследовании методом ПЦР 565 больных с подозрением на высокопатогенный грипп типа А (h2N1) РНК вируса обнаружена у 213 человек (в 38% проб). По даннным серологического обследования 67 больных ( в октябре и ноябре) заболевания гриппозной этиологии составили 4,3 % (грипп А(h2N1) сезонный — 2 человека), парагрипп 3 типа — 4,5% ( 3 человека), парагрипп 2 типа — 1,5% ( 1человек).

Грипп и ОРВИ. Лабораторная диагностика

Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) — это всегда неприятно. Мы наиболее подвержены этим заболеваниям в холодное время года.

По данным Роспотребнадзора в общей структуре инфекционной заболеваемости грипп и другие респираторные вирусные инфекции составляют до 90% (примерно 30 млн. случаев в год). По информации НИИ гриппа Министерства Здравоохранения России эпидемия гриппа в этом году начнется достаточно поздно — в декабре, в осенний период будет наблюдаться умеренная циркуляция «не гриппозных» возбудителей ОРВИ.

Первичное размножение респираторных вирусов происходит в слизистой оболочке верхних дыхательных путей, поэтому начало болезни сходно по своей клинической картине. В дальнейшем развиваются различные симптомы, характерные для конкретного возбудителя. Обычно ОРВИ протекают легче, чем грипп, который часто принимает эпидемическое распространение.

Тем не менее, иногда при инфицировании респираторными вирусами и вирусами гриппа могут развиваться тяжелые формы инфекции с осложнениями. Наибольшему риску подвержены дети, беременные женщины, люди старше 65 лет, а также медработники, работники детских и закрытых учреждений. Кроме этого, если у человека уже есть проблемы с сердцем, диабет, хронические заболевания печени и почек, заболевания легких, инфекция может усугубить эти проблемы.

В случае заболевания очень важно назначить своевременное и эффективное лечение, направленное не только на устранение симптомов заболевания, но и на возбудителя.

Быстрая и точная лабораторная диагностика имеет большое значение для идентификации возбудителей и является важным моментом для назначения терапии.

Вирусологическая лаборатория ФБУЗ проводит исследования различных видов клинического материала на обнаружение возбудителей гриппа и ОРВИ.

Диагностика осуществляется с помощью современных экспресс — методов и позволяет идентифицировать возбудителей вирусных инфекций в кратчайшие сроки:

— метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — основан на обнаружении в клинических пробах генетического материала вирусов (РНК или ДНК)- является наиболее современным, высокочувствительным методом. Исследуемый материал: мазки из носа и зева, взятые в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни, секционный материал;

Возбудители гриппа и ОРВИ, определяемые методом ПЦР:

• Вирусы гриппа А и В;
• Вирусы птичьего гриппа (А/Н5,Н7,Н9);
• Вирусы гриппа А(Н1N1)pdm; А(Н3N2); А(Н1N1);
• Аденовирусы;
• Вирусы парагриппа 1-4 типов;
• Респираторно — синтициальный вирус;
• Метапневмовирус;
• Коронавирус;
• Риновирус;
• Бокавирус;
• Микоплазма пневмонии;
• Хламидофила пневмонии.

— метод флюоресцирующих антител (МФА) — основан на выявлении вирусных антигенов в клетках эпителия носовых ходов, конъюнктивы (при явлениях конъюнктивита). Исследуемый материал: мазки из носа, конъюнктивы, взятые в первые 3 дня и не позднее 5 дня болезни;

Возбудители гриппа и ОРВИ, определяемые методом МФА:

• Вирусы гриппа А и В;
• Вирусы птичьего гриппа (А/Н5,А/Н7);
• Вирусы гриппа А(Н1N1)pdm; А(Н3N2); А(Н1N1);
• Аденовирусы;
• Вирусы парагриппа 1- 3 типов;
• Респираторно — синтициальный вирус.

Диагностические исследования выполняются на современном оборудовании высококвалифицированным персоналом по доступным ценам. Забор материала проводится в медицинских учреждениях.

Провести исследование можно по адресу: г. Липецк, ул. Гагарина, д. 60а. Часы работы с 08:00 до 16:00; выходной: суббота, воскресенье; тел. (4742) 308-706.

* При подготовке информации использованы материалы еженедельного бюллетеня информационного мониторинга ситуации по гриппу ФБУН ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» (выпуск №287, 288).

Ссылки по теме:

Вирусологическая лаборатория

Грипп

Возбудители гриппа — РНК-содержащие вирусы, относятся к семейству Orthomyxoviridae, в котором выделяют три рода — Influenzavirus A, Influenzavirus В и Influenzavirus С, каждый из которых имеет по одному виду — Influenza A virus, Influenza В virus и Influenza С virus. Вирусы гриппа А и В ежегодно вызывают эпидемии большей или меньшей интенсивности практически во всех странах мира. Вирусы гриппа А широко распространены в природе, их выделяют от большинства зверей и птиц, в связи с чем они имеют высокий пандемический потенциал, так как способны преодолевать межвидовые барьеры. Вирусы гриппа В выделяли только от людей. Вирусы гриппа С вызывают спорадические заболевания в форме ОРЗ. Вирусы гриппа А, В и С дифференцируют друг от друга с помощью иммунологических и молекулярно-генетических методов. Вирусы гриппа А дополнительно типируют на подтипы (или субтипы) в соответствии с антигенной структурой поверхностных гликопротеинов: гемагглютинина — на 16 субтипов и нейраминидазы — на 9 субтипов.

Эпидемии гриппа отличает высокая смертность, варьирующая среди разных возрастных групп и достигающая максимума у детей до 5 лет, пожилых людей и лиц с хроническими заболеваниями органов дыхания и сердечно-сосудистой системы. Однако во время пандемии гриппа в 2009 г., вызванной так называемым «свиным гриппом» А/h2N1pdm2009 (или A/h2N1sw2009), наибольший уровень летальности отмечался среди лиц от 30 до 64 лет. К группе риска относились лица, страдающие ожирением, заболеваниями сердечно-сосудистой системы и беременные женщины.

После перенесенного гриппа нередко наблюдаются осложнения в виде отитов и синуситов, пневмонии, вследствие присоединения бактериальных инфекций. Наиболее опасен грипп возможным быстрым развитием вирусной пневмонии с геморрагическим синдромом, приводящей к острой дыхательной недостаточности, что характерно для гриппа А/h2N1pdm2009. Дифференциальная диагностика гриппа и других ОРВИ возможна только с помощью лабораторных методов исследования.

Показания к обследованию. Острое начало с высокой лихорадкой (выше 38°С), продолжающейся до 3-х дней и синдромом интоксикации (головная боль преимущественно в области лба, боль в глазных яблоках, ломота в мышцах, сильная слабость) с последующим развитием катаральных явлений.

Материал для исследований

• Мазки из носоглотки — культуральное исследование, обнаружение АГ;
• мокрота, плевральная жидкость, аспираты из зева, БАЛ — выявление РНК вирусов (поражение нижних дыхательных путей);
• мазки со слизистой носоглотки и ротоглотки — выявление РНК вирусов (поражение верхних дыхательных путей);
• сыворотка крови — обнаружение АТ.

Этиологическая лабораторная диагностика включает культуральное исследование, выявление РНК возбудителей и их АГ, обнаружение специфических АТ.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики. Культуральное исследование основано на изоляции вирусов в живых культурах клеток млекопитающих или на развивающихся куриных эмбрионах с последующим определением активности гемагглютинации (агглютинации вирусами эритроцитов) и идентификацией субтипов гемагглютинина в реакции торможения гемагглютинации с типоспецифическими сыворотками. Методы отличаются трудоемкостью и длительностью, во многом зависят от качества не стандартизованных реагентов, в связи с чем для рутинной диагностики практически не используется, но применяется в эпидемиологических исследованиях.

Для обнаружения АГ вирусов гриппа применяют методы ИХА, ИФА, РИФ (МФА). Метод РИФ обладает низкой чувствительностью, недостаточной специфичностью и отличается субъективностью при интерпретации результатов анализа. При использовании ИХА велика вероятность ложноположительных результатов вне эпидемического подъема гриппа и ложноотрицательных — во время эпидемического подъема. Кроме того, быстрые тесты на основе РИФ и ИХА характеризуются низкой чувствительностью к пандемическому, так называемому «свиному» гриппу (40-60%). В связи с чем CDC для быстрой диагностики нового варианта гриппа А/h2N1pdm2009 рекомендовал использовать выявление РНК вируса методом ПЦР.

Использование в качестве мишени специфичных консервативных участков генома вирусов гриппа обуславливает высокие показатели диагностической чувствительности и специфичности ПЦР, приближающихся к 100% по сравнению с культуральной диагностикой. Преимуществами такого способа диагностики являются короткие сроки выполнения анализа, а также возможность типирования вирусов гриппа А и В и идентификации субтипа вирусов гриппа А, в том числе — нового пандемического варианта «свиного» вируса гриппа. Максимальный уровень специфичности и чувствительности имеют наборы реагентов с использованием ПЦР в режиме «реального времени».

При выявлении специфических АТ оценивают нарастание их титра в образцах крови полученных с интервалом в 2 недели (парные сыворотки) с использованием методов РТГА, РСК. Результаты в значительной степени зависят от состояния иммунной системы пациента.

Показания к применению различных лабораторных исследований. Выявление РНК вирусов гриппа методом ПЦР используется для быстрой этиологической диагностики гриппа и скрининга клинического материала в целях эпидемиологического надзора. Выявление АТ используется для определения уровня коллективного гуморального иммунитета, ретроспективной диагностики и ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек гриппа.

Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Исследования методом ПЦР позволяют обнаружить РНК вируса гриппа А, В или С и/или определить подтип вируса гриппа А. Несоблюдение техники получения мазков из носоглотки и ротоглотки или использование данного материала при диагностике вирусной пневмонии, может сильно снизить информативность исследования вплоть до получения отрицательного результата.

Учитывая возможность сочетанного инфицирования вирусами гриппа и другими возбудителями ОРЗ, желательно проведение исследования полного спектра возбудителей.

В связи с недостаточной чувствительностью тестов для выявления АГ методами РИФ и ИХА получение отрицательных результатов при их использовании не исключает возможного инфицирования.