Вирус гриппа А/B, качественное определение РНК (Influenza virus A/B, quality, RNA)

[09-120] Influenza virus A/B (вирусы гриппа А/В), РНК [реал-тайм ПЦР]

1230 руб.

Выявление вируса гриппа серотипов А и В (Influenza virus A/B), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется генетический материал (РНК) вируса в образце биоматериала.

Синонимы русские

Грипп А/В.

Синонимы английские

Influenza serotypes A/B, RNA [real- polymerase chain reaction, RT-PCR, quantitative RT-PCR, qPCR, qRT-PCR].

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок из зева (ротоглотки) и носа, мокроту.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Рекомендуется употребить большой объем жидкости (воды) за 8-12 часов до сбора мокроты.
Не принимать пищу, не пить и не полоскать горло в течение 2-3 часов до исследования.
За 3-4 часа до взятия мазков из ротоглотки (зева) и носа не употреблять пищу, не пить, не чистить зубы, не полоскать рот/горло, не закапывать капли/спреи в нос, не жевать жевательную резинку, не курить. Взятие мазков оптимально выполнять утром, сразу после ночного сна.

Общая информация об исследовании

Influenza virus — это оболочечный вирус, характеризующийся наличием сегментированного негативного РНК-генома и нуклеокапсида в форме спирали. Он относится к семейству Orthomixoviridae. На основании структурных различий нуклеопротеида выделяют 3 серотипа Influenza: A, B и С. Серотип A встречается как людей, так и у животных, в то время как варианты B и C поражают преимущественно людей. Именно серотип А ответственен за подавляющее большинство случаев сезонных (эпидемических) и пандемических вспышек гриппа.

Идентификация вируса гриппа должна быть осуществлена в кратчайшие сроки, что связано с высокой заразностью этого заболевания. Кроме того, эффективность противовирусных препаратов максимальна при их назначении в первые 48 часов после инфицирования, что также диктует необходимость своевременной постановки окончательного диагноза. Среди многих «быстрых» диагностических тестов особое место занимает полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (РТ-ПЦР). Полимеразная цепная реакция в реальном времени (РТ-ПЦР) — это метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале (например, в мокроте) фрагменты генетического материала (РНК) возбудителя инфекции. Благодаря высокой чувствительности и специфичности метода, а также возможности получить результат в наболее короткие сроки, РТ-ПЦР заменила другие, применяемые ранее, методы диагностики гриппа: выделение вируса в культуре клеток, а также серологические исследования и иммуноферментный анализ.

Многие прямые лабораторные тесты, разработанные для идентификации Influenza, основаны на выявлении белковых компонентов наружной оболочки вируса: гемагглютинина (H) и нейраминидазы (N). Эти белки являются основными факторами, определяющими степень болезнетворности вируса, а также используются для диагностики и классификации выявляемого вируса гриппа. Они обладают выраженной изменчивостью (известно 16 разновидностей N и 9 разновидностей H серотипа Influenza A) (чем вызваны ежегодные сезонные вспышки гриппа), а также создает определенные трудности при идентификации вируса гриппа с помощью этих методов. Структурное разнообразие антигенов H и N приводит к тому, что чувствительность большинства прямых лабораторных тестов (таких как прямая иммунофлюоресценция и ELISA) составляет около 65-75 %. Исследование РТ-ПЦР основано на выявлении консервативной последовательности ДНК, общей для разных штаммов вируса гриппа серотипов А и В, что обуславливает максимальную чувствительность этого теста (98-100 %).

В отличие от других тестов, чувствительность исследования РТ-ПЦР практически не изменяется при взятии материала на фоне начатой терапии противовирусными препаратами. Это связано с тем, что в реакции выявляется не сам вирусный агент, а фрагмент вирусной ДНК. По этой же причине положительный результат исследования не всегда указывает на наличие живого вируса (репликацию) и не всегда означает, что пациент остается заразным для окружающих.

В отличие от других лабораторных тестов (в первую очередь, экспресс-тестов для определения антигена вируса гриппа), результат РТ-ПЦР в меньшей степени зависит от распространенности гриппа среди населения. РТ-ПЦР характеризуется редкими ложноположительными и ложноотрицательными результатами как во время эпидемии, так и в период низкой заболеваемости гриппом.

Идентификация вируса гриппа с помощью РТ-ПЦР возможна в течение более длительного времени от начала заболевания по сравнению с большинством других тестов. Тем не менее взятие отделяемого носо/ротоглотки для исследования с помощью РТ-ПЦР должно быть произведено не позднее чем через 72-96 часов (оптимально в первые 48-72 часа). Это связано с тем, что интенсивная репликация Influenza при поражении верхних дыхательных путей происходит в течение первых 4 суток заболевания. У пациентов с вовлечением нижних отделов дыхательных путей вирусная нагрузка сохраняется высокой более длительный период. Исследование отделяемого носоглотки и мокроты дает лучшие результаты по сравнению с исследованием отделяемого ротоглотки.

При обследовании пациента с клиническими признаками Influenza-ассоциированной инфекции верхних дыхательных путей следует выполнить анализ отделяемого носо/ротоглотки. При обследовании пациента с признаками Influenza-ассоциированной инфекции нижних дыхательных путей анализ мазков из зева и носа необходимо дополнить исследованием мокроты. Исследование мокроты также должно быть осуществлено при отрицательном результате, который дал анализ отделяемого верхних дыхательных путей у пациента с клиническими признаками гриппа. Следует повторить РТ-ПЦР при отрицательном результате исследования мокроты у пациента с клиническими признаками Influenza-ассоциированной инфекции нижних дыхательных путей.

Для более точной диагностики Influenza рекомендуется сочетание РТ-ПЦР с дополнительными общеклиническими исследованиями. Кроме того, необходимо исключить бактериальную суперинфекцию.

Для чего используется исследование?

Для диагностики гриппа.

Когда назначается исследование?

При симптомах:

острой респираторной вирусной инфекции (внезапное острое начало болезни, лихорадка, боль в горле, боль в мышцах, головная боль, светобоязнь, сухой кашель, боль в грудной клетке, одышка);
острой энцефалопатии в период эпидемии гриппа (судороги, атаксия, нарушение сознания).

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата:

Influenza-ассоциированная инфекция.

Причины отрицательного результата:

отсутствие Influenza-ассоциированной инфекции.

Важные замечания

Положительный результат исследования не означает, что пациент остается заразным для окружающих.
Анализ не позволяет выявлять Influenza серотипа С.

Также рекомендуется

Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с микроскопией мазка крови при выявлении патологических изменений)
Mycoplasma pneumoniae, ДНК [реал-тайм ПЦР]
Adenovirus, ДНК [реал-тайм ПЦР]
Streptococcus pneumoniae, ДНК [реал-тайм ПЦР]

Кто назначает исследование?

Инфекционист, педиатр, врач общей практики, анестезиолог-реаниматолог.

Литература

Kamps B. S, Hoffmann C, Preiser W. Influenza Report 2006 / B. S. Kamps, С. Hoffmann, W. Preiser W. — Flying Publisher, 2006.
Wang R, Taubenberger JK. Methods for molecular surveillance of influenza. Expert Rev Anti Infect Ther. 2010 May;8(5):517-27.
Schuchat A, Bell BP, Redd SC. The science behind preparing and responding to pandemic influenza: the lessons and limits of science. Clin Infect Dis. 2011 Jan 1;52 Suppl 1:S8-12.
Pregliasco F, Mensi C, Camorali L, Anselmi G. Comparison of RT-PCR with other diagnostic assays for rapid detection of influenza viruses. J Med Virol. 1998 Oct;56(2):168-73.
WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza. — World Health Organization, 2011.

Содержание

Вирус гриппа А/B, качественное определение РНК (Influenza virus A/B, quality, RNA)

Метод определения Полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени (Real- PCR).

Исследуемый материал Соскоб эпителиальных клеток рото- и носоглотки

Определение РНК вируса гриппа в соскобе эпителиальных клеток ротоглотки и носоглотки методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени.

Грипп — острая респираторная вирусная инфекция, передаваемая воздушно-капельным путем.

Возбудители гриппа — РНК-содержащие вирусы, относящиеся к семейству Orthomyxoviridae, в котором выделяют три рода: Influenza A virus, Influenza B virus, Influenza C virus.

Вирусы гриппа А и В ежегодно вызывают эпидемии большей или меньшей интенсивности практически во всех странах мира. Вирусы гриппа А широко распространены в природе, их выделяют у большинства зверей и птиц, в связи с чем они имеют высокий пандемический потенциал, так как способны преодолевать межвидовый барьер. Основной причиной возникновения эпидемий и пандемий гриппа является высокая вариабельность вируса вследствие изменений в его геноме. Это касается фрагментов, кодирующих поверхностные антигены вирусов типов А и В и определяющих их специфичность.

Вирусы Influenza А и B поражают преимущественно верхние отделы дыхательных путей: нос, горло, трахею и реже бронхи. Однако симптомы общей интоксикации при гриппе доминируют над умеренными катаральными проявлениями. Обычно заболевание сопровождается резким повышением температуры, мышечными и головной болями, сильным недомоганием, сухим кашлем, болью в горле и слизистыми выделениями из носа. Для гриппа, обусловленного новым или значительно измененным вирусом (например, для гриппа птиц типа А(H5N1) и А(H7N9), реже А (h2N1) pdm 2009), характерно острейшее, молниеносное начало, развитие различных вариантов токсикоза (нейротоксикоза, инфекционно-токсического шока в сочетании с гемодинамическими расстройствами) и III степени ДВС-синдрома (гемокоагуляционного шока).

Диагностика инфекции осуществляется комплексно, на основании анамнестических данных о контакте с больными гриппом и характерной клинической картины. Подтверждение диагноза возможно с помощью лабораторных исследований, что целесообразно при наличии клинических проявлений гриппа, в эпидемический сезон роста заболеваемости острыми респираторными инфекциями, при тяжелом течении респираторных болезней.

В качестве базовых тестов могут быть использованы следующие лабораторные исследования: определение антигенов вируса гриппа в мазках слизистой носа и ротоглотки методом непрямой иммунофлуоресценции или иммунохроматографии; определение антител к антигенам вируса гриппа А/B в сыворотке крови методом ИФА. Результаты ИФА, как правило, оцениваются ретроспективно. Вследствие поздней диагностики они не влияют на коррекцию терапии, но применимы в научных целях и для эпидемиологического надзора и контроля за гриппом. Наиболее современным методом лабораторной диагностики гриппа является выявление РНК вируса методом ПЦР.

Максимального уровня специфичности и чувствительности достигают тесты на основе ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени, позволяющие обнаруживать в биологическом материале РНК возбудителя инфекции.

Аналитические показатели:

определяемый фрагмент — специфический участок нуклеиновой кислоты вирусов гриппа А (Influenza virus A) и гриппа В (Influenza virus B);

специфичность обнаружения — отсутствие неспецифических реакций в отношении других вирусных и бактериальных возбудителей ОРЗ.

Аналитическая чувствительность:

вирус гриппа А (Influenza virus A) — 1х10^3 ГЭ/мл пробы;

вирус гриппа В (Influenza virus В) — 1х10^3 ГЭ/мл пробы.

Литература

Грипп у взрослых. Клинические рекомендации. МЗ РФ. 2017:57. https://cr.rosminzdrav.ru/#!/schema/909
Грипп у детей. Клинические рекомендации. МЗ РФ. 2017:43. https://cr.rosminzdrav.ru/#!/schema/172
Грипп у взрослых: методические рекомендации по диагностике, лечению, специфической и неспецифической профилактике. Под ред. академика, профессора А.Г. Чучалина, главного внештатного инфекциониста СЗФО проф. Т.В. Сологуб. — СПб.: Издательско-полиграфический комплекс «НП-Принт». 2014:192.
Яцышина С.Б., Творогова М.Г., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Лабораторная диагностика гриппа и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции. Лабораторная служба. 2017;6(3):238-267. https://doi: 10.17116/labs201763238-267.

Отличить грипп от ОРВИ можно только при помощи лабораторных исследований!

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), включая грипп — это группа инфекционных заболеваний дыхательной системы, возбудителями которых являются вирусы. Преимущественный путь передачи — воздушно-капельный.

Наиболее распространенные возбудители ОРВИ: вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, риновирусы, рино-синцитиальный вирус, энтеровирусы, коронавирусы, пикорнавирусы и др. Несмотря на разнообразие вирусов, симптомы ОРВИ схожи. В результате внутриклеточного размножения вирусов, клетки погибают и отторгаются. Это приводит к развитию воспаления дыхательных путей. Затем вирус попадает в кровь, развивается интоксикация. Вирус гриппа, к тому же, оказывает токсическое действие на сердечно-сосудистую и нервную системы, угнетает иммунитет.

У каждого вируса есть особенности, они в большей или меньшей степени поражают разные отделы дыхательных путей, но клиническая картина в большинстве случаев схожа и даже врач не может сказать наверняка, какой из вирусов стал причиной заболевания. Поэтому однозначно утверждать природу вируса можно лишь после проведения лабораторного исследования.

Характерные черты некоторых ОРВИ

Грипп

Для гриппа характерно острое начало. Ведущий симптом — интоксикация: сильная головная боль, головокружение, боль в глазных яблоках, мышцах и суставах. Характерен озноб, быстрое повышение температуры до 39-40°С. Беспокоят заложенность носа, сухой кашель. Возможны проявления со стороны желудочно-кишечного тракта (тошнота, рвота, учащенный стул). Характерен также внешний вид болеющего — одутловатость (отёчность) и покраснение лица, покраснение конъюнктивы глаз.

Аденовирусная инфекция

При поражении аденовирусом возможны следующие формы заболевания: воспаление дыхательных путей (ринофарингит, ларингит, трахеит, бронхит), фарингоконъюнктивальная лихорадка, конъюнктивит, аденовирусная ангина, вирусная пневмония, вирусная диарея и гастроэнтерит. При поражении дыхательных путей чаще всего интоксикация выражена слабо, температура поднимается до 38°С, но при фарингоконъюнктивальной лихорадке возможно повышение до 40°С. Особенность аденовируса заключается в том, что он может поражать конъюнктиву глаз, в этом случае развивается конъюнктивит, на слизистой глаз появляется плёнка, вокруг глаз — отёк, покраснение и болезненность. Аденовирусы могут длительное время находиться в клетках миндалин, обуславливая хроническую форму тонзиллита.

Парагрипп

Интоксикация и повышение температуры при парагриппе также не выражены. На первое место выходят катаральные симптомы: затруднение носового дыхания, выделения из носа. Характерен ларингит, который сопровождается болями в горле, грубым сухим кашлем, охриплостью голоса.

Респираторно-синцитиальный вирус

При проникновении этого вируса в дыхательные пути возможно острое начало заболевания. Симптомы, похожи на симптомы парагрппа. В начале болезни часто мучает продолжительный приступообразный кашель. Респираторно-синцитиальные вирусы могут стать причинным фактором для развития в будущем бронхиальной астмы.

Риновирусная инфекция

Температура при риновирусной инфекции может не повышаться, а если повышается, то до невысоких цифр. Характерно покраснение яблок глаз, боль в горле. Для риновирусной инфекции типичны заложенность носа, нарушение вкуса и обоняния, обильные выделения из носа, чихание. Может незначительно снижаться слух.

Коронавирусы

Для коронавирусов характерны обильные выделения из носа, головная боль, кашель, фарингит. Температура редко повышается до высоких значений.

Исключение составляет новая коронавирусная инфекция 2019 года.

Последствия гриппа и ОРВИ

После ОРВИ возможны многие серьезные заболевания. Чаще прочего развивается бронхит. Возможны отиты и синуситы, пневмония. Респираторно-синцитиальный вирус, метапневмовирус, вирусы гриппа и аденовирусы вызвают бронхиты и пневмонию преимущественно у детей до 5 лет. Поражаются также органы не дыхательной системы, поэтому осложнением вирусной инфекции, чаще гриппа, может стать миокардит (воспаление сердечной мышцы), пиелонефрит и другие заболевания.

Инфицирование детей до 2х лет респираторно-синцитиальным вирусом, вирусами парагриппа и бокавирусом может привести к тяжелым состояниям, требующим госпитализации — крупу и бронхо-обструктивному синдрому.

Каким возбудителем инфицирован человек, может сказать только лабораторная диагностика, по клинической картине, к сожалению, это сделать невозможно. Лабораторный анализ на определение гриппа и других возбудителей респираторной инфекции даёт возможность назначить адекватное лечение, определить прогноз, не допустить характерных для каждого возбудителя осложнений и избежать необоснованной антибиотикотерапии.

Где можно сдать анализ на грипп?

Сдать анализ на вирус гриппа и других возбудителей респираторных инфекций можно в Центре Молекулярной диагностики (CMD. Целесообразно сдавать анализ на выявление гриппа и возбудителей ОРВИ при подозрении на вирусную инфекцию в первые — вторые сутки заболевания, когда возбудитель содержится в организме в максимальном количестве.

Диагностика гриппа и острых респираторных вирусных инфекций в CMD:

Вирус гриппа (Myxovirus influenzae) А и В, качественное определение РНК, ПЦР
Вирус гриппа (Myxovirus influenzae) А и В/ Вирус парагриппа (Parainfluenzae virus) 1,2,3,4 типов, качественное определение РНК
Вирус гриппа (Myxovirus influenzae) А, А/Н1N1/СА/2009, В, качественное определение РНК, ПЦР
Диагностика ОРВИ. Возбудители респираторных вирусных инфекций (РНК Respiratory Syncytial virus, РНК pneumovirus, РНК Coroirus, РНК Rhinovirus, ДНК Adenovirus B, C, E, ДНК Bocavirus, РНК Parainfluenza virus 1, 2, 3, 4),качественное определение,ПЦР

Как работают диагностические тесты

Молекулярно-генетические методы, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР), способны обнаружить геном возбудителя в мазке из носоглотки заболевшего.

ПЦР — быстрый прямой метод диагностики, способный обнаружить специфичные участки генома микробов, то есть отличающие их друг от друга. Метод ПЦР по сути является экспресс-анализом на грипп и другие респираторные инфекции.

Основа метода — многократное избирательное копирование (амплификация) определённого участка ДНК/РНК с целью получения такого количества генетического материала, которого будет достаточно для визуального обнаружения. При этом многократно копируется только заданный участок генома. Так как геном уникальная часть каждого организма, ПЦР позволяет безошибочно определить какой именно вирус стал причиной болезни. Следовательно, врач, исходя из результатов этого анализа, сможет назначить лечение, которое будет эффективно в отношении конкретного вируса.

Литература:

Sprengel, «Pragmatische Geschichte der Heilkunde».
Daremberg, «Histoire des sciences médicales» (П., 1966).
Киржанова Е. А., Хуторянский В. В., Балабушевич Н. Г., Харенко А. В., Демина Н. Б. Методы анализа мукоадгезии: от фундаментальных исследований к практическому применению в разработке лекарственных форм. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2014; 3(8): 66–80. DOI: 10.33380/2305-2066-2019-8-4-27-31.
https://helix.ru/kb/item/09-120.
https://www.invitro.ru/analizes/for-doctors/3018/57323/.
https://www.cmd-online.ru/patsientam/poleznyye-statii/otlichit-gripp-ot-orvi-mozhno-tolko-pri-pomoshchi-laboratornykh-issledovaniy/.
ОФС.1.2.1.2.0003.15 Тонкослойная хроматография // Государственная фармакопея, XIII изд.
ОФС.1.2.1.1.0003.15 Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях // Государственная фармакопея, XIII изд.